ЗАКОН БУГЕРА-ЛАМБЕРТА-БЕРА УСТАНАВЛИВАЕТ, ЧТО
1) оптическая плотность светового потока определенной длины волны прямо пропорциональна концентрации растворенного вещества (+)
2) между концентрацией субстрата и скоростью ферментативной реакции есть количественное соотношение
3) осмолярность во всех жидких секторах организма должна быть одинаковой
4) активность ферментов зависит от рН среды
Верным является утверждение, что оптическая плотность (A, или оптическая плотность/экстинкция ) прямо пропорциональна концентрации растворённого вещества: A = ε·c·l, где ε — молярный коэффициент поглощения для выбранной длины волны, c — концентрация, l — длина кюветы. Практически это значит: если удвоить концентрацию или толщину слоя, поглощение удвоится, пока сохраняется линейность. Именно поэтому спектрофотометрия позволяет количественно определять концентрации биомолекул (гемоглобин, билирубин, лекарства) по измеренной A при заданной λ.
Важно помнить, что закон работает в условиях, когда раствор однороден, свет монохроматичен, а рассеяние и флуоресценция минимальны. Отклонения (мутность, химические взаимодействия, насыщение детектора) приводят к потере линейности: тогда полученная A перестаёт прямо отражать концентрацию и требуется разведение пробы, смена длины волны или коррекция фона.
| Параметр | Обозначение | Единицы | Влияние на A (OD) | Практический комментарий |
|---|---|---|---|---|
| Концентрация вещества | c | моль/л (М) или г/л | Прямая пропорциональность (A ∝ c) | Разводите пробу, если A > 1,2–1,5 для сохранения линейности. |
| Длина оптического пути | l | см | Прямая пропорциональность (A ∝ l) | Стандартные кюветы 1,0 см; микрокюветы могут быть 0,2–0,5 см. |
| Молярный коэффициент поглощения | ε | л·моль⁻¹·см⁻¹ | Задает чувствительность метода | Зависит от химической формы и длины волны. |
| Длина волны | λ | нм | Косвенно влияет через ε(λ) | Выбирайте максимум поглощения аналита для лучшего S/N. |
| Пропускание | T | доля или % | A = −log10(T) | Низкое T соответствует высокой A. |
| Матрица/растворитель | — | — | Может добавлять фон к A | Используйте соответствующий бланк для обнуления. |
| Рассеяние/мутность | — | — | Искусственно повышает A | Фильтрация/центрифугирование, выбор более длинной λ. |
| Диапазон детектора | — | — | Сатурация ломает линейность | Держите A ~ 0,1–1,0 для наилучшей точности. |
| Температура и pH | — | °C, ед. pH | Меняют ε при чувствительных реакциях | Поддерживайте стандартные условия измерения. |
| Химические взаимодействия | — | — | Смещают спектр, меняют ε | Избегайте сопоглощающих примесей; используйте дериватизацию при необходимости. |
Итог: линейная связь A = ε·c·l делает спектрофотометрию надёжным количественным методом при соблюдении условий применимости закона.